Термины и определения. Базовые понятия хроматографии.

Любой жидкостной хроматограф состоит из следующих частей: 1 – насос, 2 - узел ввода пробы, 3 - хроматографическая колонка, 4 - детектор, 5 - регистратор (самописец, интегратор или компьютер); 6 - термостат колонок, 7 - узел подготовки элюента с емкостями для элюента, 8 - слив элюата или коллектор фракций.
Принцип действия хроматографа заключается в следующем: раствор анализируемой смеси с помощью УЗЛА ВВОДА ПРОБЫ вводится в верхнюю часть хроматографической КОЛОНКИ.С помощью НАСОСА анализируемая смесь прокачивается ЭЛЮЕНТОМ (подвижная фаза ПФ) через хроматографическую КОЛОНКУ, в которой происходит разделение анализируемой смеси на отдельные вещества (компоненты). Вытекающий из колонки ЭЛЮАТ, содержащий отдельные компоненты анализируемой смеси, детектируется ДЕТЕКТОРОМ, показания которого регистрируются РЕГИСТРАТОРОМ.
Таким образом, жидкостной хроматограф предназначен для разделения сложных смесей веществ на отдельные компоненты и проведения качественного и количественного анализа компонентов разделяемой смеси.
Под такое определение попадают как жидкостные, так и газовые хроматографы. В жидкостных хроматографах в качестве подвижной фазы (ПФ) используются жидкости, а в газовых – газы.

АДСОРБЕНТ (НЕПОДВИЖНАЯ ФАЗА) - твердое вещество, способное удерживать растворенные вещества и используемые в хроматографии для заполнения хроматографических колонок.

ПРОБА – аликвота анализируемой смеси, вводимая в хроматограф.

СОРБАТ - компонент пробы, индивидуальное соединение.

НАГРУЗКА КОЛОНКИ – количество вещества в пробе. При введении в хроматограф большого объема пробы или концентрированной пробы может возникнуть ПЕРЕГРУЗКА колонки, которая выражается уширением и искажением формы пика, а также зависимостью удерживания от вводимого количества вещества. На практике желательно работать при небольших нагрузках колонки.

ЭЛЮЕНТ (подвижная фаза ПФ) - растворитель или смесь растворителей, предназначенная для прокачки анализируемой смеси через хроматографическую колонку.

ЭЛЮАТ - раствор, выходящий из хроматографической колонки.

ХРОМАТОГРАММА. Графическим результатом хроматографического процесса является хроматограмма. Хроматограмма - кривая, описывающая зависимость концентрации анализируемых веществ в элюате от времени. Хроматограммой (с точки зрения аппаратурного оформления) можно назвать зависимость отклика детектора хроматографа от времени при прохождении элюата через ячейку детектора. Хроматограмма состоит из ряда пиков, каждый из которых при полном разделении соответствует одному компоненту анализируемой пробы. Площадь пика при небольшой нагрузке колонки прямо пропорциональна концентрации компонента в элюате.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ включают тип и марку используемого хроматографа, размеры хроматографической колонки и марку используемого в ней адсорбента, состав и расход элюента, тип элюирования (изократический или градиентный) и форму градиента, объем пробы, тип детектора и условия детектирования, температуру окружающей среды или термостата колонок.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ СИСТЕМА состоит из хроматографической колонки, заполненной определенным адсорбентом, через которую при определенной температуре прокачивается элюент определенного состава.

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ ВЕЩЕСТВА tR - время пребывания адсорбата в хроматографе. На практике время удерживания определяют от момента ввода пробы вещества в хроматограф до момента регистрации максимальной амплитуды хроматографического пика адсорбата.
Каждое вещество при одних и тех же хроматографических условиях имеет свое время удерживания. Это положение является основой идентификации (качественного анализа) компонентов разделяемой смеси по временам удерживания при жестком соблюдении постоянства условий эксперимента: состава элюента, расхода элюента (объемная скорость подачи элюента), использования одной и той же колонки, минимальных колебаниях температуры окружающей среды, сравнимых количеств вещества в хроматографическом пике анализируемой смеси и стандарта.

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ НЕСОРБИРУЕМОГО ВЕЩЕСТВА tM - время пребывания несорбируемого вещества в хроматографе. Определение времени удерживания несорбируемого вещества tм является важной проблемой, так как от точности определения tM зависит точность определения величины t'R, которая, в свою очередь, является исходной для расчета ряда хроматографических характеристик. Величина tM является характеристикой конкретной хроматографической системы при постоянном расходе элюента. Так как на практике не всегда удается подобрать полностью несорбируемый компонент, да и критерии подбора такого компонента весьма расплывчаты, на практике используют время удерживания наименее сорбируемого компонента, которое также обозначается tM.

ПРИВЕДЕННОЕ ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ t'R определяется по формуле
t'R = tR - tM

УДЕРЖИВАЕМЫЙ ОБЪЕМ VR компонента - объем элюента, вытекающий за время удерживания, определяется по формуле
VR = tR * w
где w - объемная скорость подачи элюента (мкл/мин., мл/мин.)

ОБЪЕМ УДЕРЖИВАНИЯ НЕСОРБИРУЕМОГО КОМПОНЕНТА VM – объем элюента, вытекающий за время пребывания несорбируемого компонента в хроматографе. VM включает в себя свободный объем колонки, объемы устройства ввода пробы и детектора, а также объемы коммуникаций между ними.

СВОБОДНЫЙ ОБЪЕМ КОЛОНКИ V0 - часть объема колонки, не занятая сорбентом.

ПРИВЕДЕННЫЙ УДЕРЖИВАЕМЫЙ ОБЪЕМ V'R - определяется по формуле
V'R = VR - VM = t'R * w
Приведенный удерживаемый объем является объемом элюента, необходимым для вымывания анализируемого вещества только с поверхности адсорбента.

ФАКТОР ЕМКОСТИ k' определяется по формуле
k' = t'R/tM = V'R/VM
Фактор емкости является более универсальной, чем tR, характеристикой удерживания в том смысле, что k' не зависит от длины колонки и скорости подачи элюента

ЭФФЕКТИВНОСТЬ N хроматографической колонки определяется экспериментально из хроматограммы по формуле
N = 5.545 * (tR/Wh)^2, где
N - эффективность хроматографической колонки в теоретических тарелках;
tR - время удерживания;
Wh - ширина пика на полувысоте.
Согласно формуле, эффективность колонки тем больше, чем уже хроматографический пик при тех же временах удерживания.

СЕЛЕКТИВНОСТЬ (ФАКТОР РАЗДЕЛЕНИЯ) хроматографической системы при разделении двух веществ определяется экспериментально по формуле
a = t'R1/t'R2
СЕЛЕКТИВНОСТЬ – это способность хроматографической системы (адсорбента и подвижной фазы) делить данную пару соединений. В общем случае селективность является интегральным результатом межмолекулярных взаимодействий в хроматографической системе.

РАЗРЕШЕНИЕМ R называется отношение расстояния между максимумами пиков к средней арифметической ширине обоих пиков у основания:
R = 2 * (tR1 - tR2)/(W1 + W2)
Для количественного анализа обычно достаточно разрешения R = 1, так как в этом случае только примерно 2% площади пиков перекрываются.
Разрешение двух хроматографических пиков зависит от селективности хроматографической системы, удерживания сорбатов и эффективности хроматографической колонки. Такая зависимость может быть выражена формулой
R = 1/4 * (a-1)/a * k'2/(k'2 + 1) * N^1/2
где k'2 - фактор емкости второго хроматографического пика.
Как следует из этой зависимости, разрешение в общем случае зависит от трех параметров – селективности a, удерживания k' и эффективности N; чем больше их значения, тем лучше разрешение.
Увеличение параметра N на практике означает замену имеющейся колонки на более эффективную. При этом следует помнить, что разрешение пропорционально квадратному корню из эффективности, то есть для улучшения разделения в два раза требуется колонка, в четыре раза более эффективная, чем данная.
Как правило, чем больше удерживание пары пиков (больше значение k'2), тем лучше она разделяется. Практически увеличения удерживания добиваются путем уменьшения концентрации полярной добавки (в НФ ВЭЖХ) или модификатора (в ОФ ВЭЖХ) в элюенте.
Два упомянутых выше способа являются скорее «экстенсивными», и способны лишь отчасти улучшить разрешение. На практике они могут применяться, к примеру, при воспроизведении стандартных методик на местах.
Значительного увеличения разрешения можно достигнуть лишь путем регулирования селективности a. Изменения селективности можно добиться, заменив неподвижную фазу или изменив состав элюента.

====================================================
*При работе на хроматографах «Милихром» бывает полезно увеличить удерживание интересующего соединения еще и потому, что паспортная эффективность колонки достигается только при k' = 3 - 4 и выше, что связано с особенностями конструкции узла ввода пробы. Разумеется, увеличение удерживания ведет к возрастанию времени анализа, но для оператора «Милихрома» эта проблема не столь актуальна. Напротив, известные ограничения на оптимизацию разделения накладывает фиксированный максимальный объем элюента, не позволяющий достигнуть значений фактора емкости k' > 9.

===========================================================

В процессе перемещения через разделительную колонку хроматографическая зона вещества размывается. Для характеристики интенсивности размывания используется величина Н – высота, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ). Качество хроматографической колонки характеризуется эффективностью N – величиной, обратной ВЭТТ: N = L/N, где L – длина колонки. Эффективность хроматографических колонок экспериментально определяется по известной формуле:
N = 5.545*(tR/w)^2,
где N - эффективность хроматографической колонки в теоретических тарелках (т.т.);
tR - время удерживания хроматографического пика, по которому определяется эффективность;
w - ширина пика на полувысоте.
Термин «теоретическая тарелка» (т.т.) появился благодаря концепции, предложенной Мартином и Синджем. Хроматографическая колонка разбивается на ряд "тарелок" (подобно ректификационной колонне) – слоев, на каждом из которых происходит единичный акт адсорбции-десорбции при условии отсутствия диффузионного переноса анализируемого вещества между слоями. Такой подход является формальным, так как не учитывает реальные механизмы размывания. Основным следствием теории теоретических тарелок является описание профиля хроматографического пика Гауссовой кривой.
Основные причины размывания зоны вещества в колонке – молекулярная диффузия, вихревая диффузия и медленный массообмен в хроматографической системе.
Вклад этих факторов в общую величину размывания зависит от скорости подвижной фазы. Экспериментальная зависимость ВЭТТ от скорости потока имеет вид кривой, приведенной на рисунке 1 (см. раздел "рисунки"); лучше всего ее можно описать с помощью уравнения ван Деемтера:
H = A + B/u + C1*u + C2*u,
где u – линейная скорость подвижной фазы.
Долю размывания полосы, которая не зависит от скорости потока (слагаемое А), приписывают вихревой диффузии, возникающей при омывании зерен адсорбента потоком растворителя. Слагаемое В/u описывает размывание полосы, вызываемое молекулярной (продольной) диффузией адсорбата в подвижной фазе.
Процесс адсорбции-десорбции в хроматографической системе протекает не мгновенно, а с некоторой конечной скоростью. Если время, необходимое для установления адсорбционного равновесия, становится сравнимым со временем удерживания соединения, происходит дополнительное размывание его зоны в колонке. Этот эффект характеризуют два слагаемых – C1*u и C2*u. Первое слагаемое описывает процесс миграции молекул адсорбата из подвижной фазы к поверхности частиц (внешний массообмен); второе слагаемое описывает процесс диффузии внутрь зерна по системе пор адсорбента (внутренняя диффузия).

==========================================================
* Экспериментально эффективность хроматографических колонок должна определяться в оптимальных условиях: расход элюента для колонок длиной 60 - 120 мм и внутренним диаметром 2 мм лежит в диапазоне от 70 до 150 мкл/мин. Обычный расход элюента при использовании хроматографов серии "Милихром"- 100 мкл/мин в обращенно-фазном и 150 мкл/мин в нормально-фазном режимах ВЖХ. Значение коэффициента емкости хроматографического пика должно находиться в диапазоне 7-9; при этом должно отсутствовать уширение хроматографических пиков, обусловленное межмолекулярными взаимодействиями. Внеколоночное уширение необходимо свести к минимуму. Элюент должен быть составлен таким образом, чтобы не происходило адсорбционное модифицирование адсорбента. Максимальная эффективность достигается при температуре окружающей среды 18 - 22Сo, при минимальном объеме и количестве вещества в пробе. Несоблюдение этих правил может привести к уменьшению эффективности хроматографической колонки в 2–3 раза (!). Реальная эффективность колонки также сильно зависит от размывания пробы во внеколоночных элементах конструкции хроматографа: в узле ввода пробы (инжектор), в соединении между инжектором и хроматографической колонкой, в соединении между колонкой и кюветой детектора, в самой кювете детектора. Например, автоматизация узла ввода пробы в хроматографах "Милихром-2" и "Милихром-4" привела к потере в среднем около 15% эффективности колонки по сравнению с обычным "Милихромом". Конечно, изменить конструкцию прибора в большинстве случаев не удается, но уменьшить длину капилляров, соединяющих узел ввода пробы и колонку, а также колонку и детектор - просто необходимо. Тем не менее, эффективность колонки лучше измерять на хроматографах серии "Милихром". В реальном анализе эффективность колонки может быть значительно ниже указанной в паспорте. Так происходит тогда, когда не удается устранить уширение хроматографического пика, обусловленное межмолекулярными взаимодействиями (обычный случай для обращенно-фазового варианта ).
При тестировании хроматографических колонок, заполненных силикагелем, может быть использована смесь о-, м-, и п-нитроанилинов в качестве адсорбатов и элюент гексан-хлороформ -изопропанол в соотношении 70:22:8 или 70:20:6 по объему. Расчет эффективности производится по хроматографическому пику п-нитроанилина.
Тестирование колонок, заполненных обращенно-фазными адсорбентами (химически алкил-модифицированные силикагели типа С8, С16 и С18) лучше производить смесью бензол-нафталин-антрацен или нафталин-антрацен-м-терфенил при использовании элюента ацетонитрил-вода в соотношении от 60:40 до 75:25 по объему в зависимости от содержания углерода в адсорбенте. Для сорбентов, содержащих 12-14% углерода предпочтительнее элюенты ацетонитрил-вода в соотношении 60:40. При содержании углерода 16-18% и выше используются элюенты с содержанием ацетонитрила, большим 70% по объему. Расчет эффективности ведется по антрацену или м-терфенилу. При подготовке колонки к анализу бенз(а)пирена, расчет эффективности целесообразнее проводить по бенз(а)пирену. В этом случае используются элюенты ацетонитрил-вода в соотношении 75:25 или 80:20.