Обращенно-фазная ВЭЖХ

Общая характеристика метода. Неподвижные фазы для ОФ ВЭЖХ.

Термин «обращенно-фазная хроматография» означает, что для хроматографического разделения применяюся «обращенные» по отношению к полярным, то есть неполярные неподвижные фазы. Подвижная фаза в ОФ ВЭЖХ является полярной и обычно представляет собой смесь полярного органического растворителя с водой (водным буфером). Простое эмпирическое правило для оценки удерживания в ОФ ВЭЖХ можно сформулировать так – чем гидрофобнее соединение, тем сильнее оно удерживается.
Самой распостраненной неподвижной фазой для ОФ ВЭЖХ является силикагель, химически модифицированный алкилсиланами Сl-Si(CH3)2-R, где R – алкильная цепь с числом атомов углерода от 1 до 18 (иногда, до 32). Среди химически модифицированных силикагелей наибольшее распостранение получили фазы с восемью (С8) и восемнадцатью (С18 или октадецилсисилированный силикагель, ОДС) атомами углерода. Также в ОФ ВЭЖХ применяются силикагели Фенил ( R = -(CH2)3Ph) и Циано ( R = -(СH2)3CN). Основной характеристикой обращенно-фазного адсорбента на основе силикагеля является массовая доля углерода. Эта величина отражает гидрофобность неподвижной фазы и, таким образом, и ее адсорбционную способность. Массовая доля углерода стандартной С8 фазы составляет величину порядка 12%; стандатной С18 фазы – 16-20%.
В качестве обращенных фаз могут применяться различные полимерные материалы. Среди последних прежде всего стоит выделить поли(дивинилбензол/метакрилат) и поли(стирол/дивинилбензол). Обычно эти материалы являются сшитыми, и совместимы с подвижными фазами, содержащими оргпнический растворитель. Полимерные материалы имеют значительно большую гидрофобность, нежели алкилпривитые силикагели.

Закономерности удерживания в ОФ ВЭЖХ. Элюирующая сила растворителей, элюотропный ряд. Регулирование селективности в ОФ ВЭЖХ.

Как уже было отмечено, разделение в ОФ ВЭЖХ происходит за счет разницы в гидрофобности адсорбатов.
Рассмотрим систему, состоящую из двух расслаивающихся фаз. Одной фазой является органический растворитель, насыщенный водой, а другой – вода, насыщенная органическим растворителем. Гидрофобность можно определить как свойство вещества преимущественно концентрироваться в органической фазе. Самой простой оценкой гидрофобности является растворимость соединения в воде. Чем меньше вещество растворяется в воде, тем больше его гидрофобность и тем больше оно удерживается в ОФ ВЭЖХ.
Для оценки гидрофобности соединения чаще всего используется коэффициент распределения с системе октанол-вода. В том случае, если вещество жидкое и не растворяется в воде, критерием гидрофобности может служить значение межфазного поверхностного натяжения с системе вещество-вода.
В том случае, если соединение обладает несложной структурной формулой, гидрофобность соединения можно рассчитать по аддивной схеме. Одной из таких схем является метод ГЛБ (гидрофильно-липофильного баланса). Основным структурным звеньям и функциональным группам приписываются инкременты, положительные для неполярных фрагментов и отрицательные для полярных и в особенности ионных функциональных групп.
На практике, аналитик оценивает гидрофобность соединения на взляд, по структурной формуле, опираясь на свой опыт работы.
По способности вытеснять адсорбат с поверхности адсорбента в режиме ОФ ВЭЖХ органические растворители, так же как и в случае НФ ВЭЖХ, можно расположить в элюотропный ряд. Минимальной элюирующей силой обладает вода. Значительно большей элюирующей силой обладают органические растворители. Наиболее часто применяемые в ОФ ВЭЖХ растворители можно расположить в следующий элюотропный ряд (по возрастанию элюирующей способности): метанол < ацетонитрил < изопропанол < тетрагидрофуран. Все подвижные фазы промежуточной элюирующей силы получаются смешиванием органического растворителя с водой (водным буфером) в различной пропорции.
В ОФ ВЭЖХ органический растворитель называется модификатором. Не следует путать термины «модификатор» в ОФ и НФ ВЭЖХ.
Для анализа гидрофильных соединений обычно применяют неподвижные фазы с высоким содержанием углерода (С18 привитые силикагели, полимерные материалы) и подвижные фазы с низким содержанием модификатора. Для анализа гидрофобных соединений обычно применяют неподвижные фазы с пониженным содержанием углерода (С8, С4, Фенил и Циано фазы) и/или подвижные фазы с высоким содержанием модификатора.
Основным недостатком обращенно-фазной ВЭЖХ по сравнению с нормально-фазной ВЭЖХ является ограниченные возможности метода в плане регулирования селективности хроматографической системы.
С другой стороны, «гибкости» метода НФ ВЭЖХ противопоставляется «простота и предсказуемость» метода ОФ ВЭЖХ. Порядок элюирования неионных соединений в режиме обращенно-фазной хроматографии фактически фиксирован, регулировать можно лишь удерживание.
При неудовлетворительном разделении в ОФ ВЭЖХ его улучшения обычно добиваются не регулированием селективности, как в НФ ВЭЖХ, а другими путями: заменой хроматографической колонки на более эффективную или уменьшением скорости потока (разделение возрастает пропорционально квадратному корню из эффективности), увеличение удерживания за счет уменьшения модификатора в элюенте (разделение возрастает пропорционально k/(k+1)), или применением градиентного элюирования.
Небольшого изменения селективности можно добиться путем замены неподвижной фазы на аналогичную; С18 фазы различных фирм-произвоителей обычно немного различаются по селективности. В некоторых случаях небольшого изменения селективности можно добиться, применяя смешанные модификаторы. Так, при анализе гидроксилсодержащих соединений селективность системы можно регулировать, изменяя соотношение метанола и ацетонитрила в системе ацетонитрил-метанол-вода, или применяя вместо метанола изопропанол или бутанол.
Значительного изменения селективности обращенно-фазной системы можно добиться в случае анализа ионных соединений путем применения подвижных фаз с добавками алифатических кислот, аминов и огранических солей. Режимы обращенно-фазной хроматографии с применением таких подвижных фаз имеют собственные названия: ион-парная обращенно-фазная хроматография (ИП ОФ ВЭЖХ) и мицеллярная хроматография.